ELISA試劑盒檢測原理：

試劑盒采用(yong)(yong)雙抗體(ti)一步夾心法酶(mei)聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先(xian)包被（Aflatoxin）抗體(ti)的包被微孔中(zhong)，依次加入標(biao)本(ben)、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的檢測抗體(ti)，經過溫育并*洗滌。用(yong)(yong)底物(wu)TMB顯色(se)，TMB在過氧化(hua)(hua)物(wu)酶(mei)的催化(hua)(hua)下(xia)(xia)轉(zhuan)化(hua)(hua)成藍(lan)色(se)，并在酸(suan)的作用(yong)(yong)下(xia)(xia)轉(zhuan)化(hua)(hua)成終的黃色(se)。顏色(se)的深淺和(he)樣品(pin)中(zhong)的（Aflatoxin）呈正相關。用(yong)(yong)酶(mei)標(biao)儀在450nm 波長下(xia)(xia)測定吸光度（OD 值），計(ji)算(suan)樣品(pin)濃度。

樣品收集、處理及保存方法：

1.  血清：使用不含熱原和(he)內毒素的(de)試管，操作過程中避(bi)免任(ren)何細胞刺激，收(shou)集血液后(hou)，3000轉離(li)(li)心10分鐘將血清和(he)紅(hong)細胞迅(xun)速小(xiao)心地分離(li)(li)。

2.  血漿：EDTA、檸(ning)檬酸鹽或肝(gan)素抗凝。3000轉離心(xin)30分鐘取上清。

3.  細胞上(shang)清液：3000轉離心10分鐘去(qu)除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加(jia)入適量生理鹽(yan)水(shui)搗碎。3000轉離(li)心10分鐘取上清。

5.  保存(cun)：如果樣(yang)本(ben)收集后不及(ji)時檢(jian)測(ce)，請按一(yi)次用(yong)量分(fen)裝(zhuang)，凍(dong)(dong)存(cun)于(yu)-20℃，避免反(fan)復凍(dong)(dong)融，在室溫下解凍(dong)(dong)并(bing)確(que)保樣(yang)品均勻(yun)地充分(fen)解凍(dong)(dong)。

自備(bei)物品(pin)

1.酶標儀(yi)（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

ELISA試劑盒操作注意事項：

1、試劑盒(he)保(bao)存在2-8℃，使用前室(shi)溫(wen)平衡20分鐘。從冰箱取(qu)出的濃縮(suo)洗滌液會有結晶，這屬(shu)于正常現象，水浴加熱使結晶*溶(rong)解后再使用。

2、實(shi)驗中(zhong)不用(yong)的板條應立即(ji)放回(hui)自封(feng)袋(dai)中(zhong)，密(mi)封(feng)（低溫干燥）保存。

3、濃度為(wei)(wei)0的S0號標(biao)準品(pin)即(ji)可視為(wei)(wei)陰性對照(zhao)或者空白(bai)；按照(zhao)說明書(shu)操作(zuo)時樣(yang)本已(yi)經稀釋5倍，終結(jie)果(guo)乘以5才(cai)是樣(yang)本實(shi)際濃度。

4、嚴格按照(zhao)說明(ming)書中(zhong)標明(ming)的時(shi)間、加液量(liang)及(ji)順序(xu)進行溫育(yu)操(cao)作。

5、所(suo)有液體(ti)組分(fen)使用前充(chong)分(fen)搖勻(yun)。

試(shi)劑盒(he)組成：

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、2.5、5、10、20、40 ppb

試劑(ji)的準備：

20×洗滌(di)緩沖(chong)液(ye)的稀(xi)釋：蒸(zheng)餾(liu)水(shui)按1：20稀(xi)釋，即1份的20×洗滌(di)緩沖(chong)液(ye)加19份的蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

洗板(ban)方(fang)法：

1.手工洗(xi)板(ban)：甩盡孔(kong)內液(ye)(ye)體，每(mei)孔(kong)加(jia)滿洗(xi)滌液(ye)(ye)，靜置(zhi)1min后甩盡孔(kong)內液(ye)(ye)體，在吸(xi)水紙(zhi)上(shang)拍(pai)干，如此洗(xi)板(ban)5次。

2.自動洗板(ban)機(ji)：每孔(kong)注入洗液350μL，浸泡1min，洗板(ban)5次。

操作步驟：

1.從室(shi)溫平衡20min后的鋁箔袋(dai)中取出所需板(ban)(ban)條(tiao)，剩余板(ban)(ban)條(tiao)用自封(feng)袋(dai)密封(feng)放回(hui)4℃。

2.設置標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)孔和樣本孔，標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)孔各加(jia)不同濃度的標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)50μL；

3.樣本(ben)(ben)孔(kong)先加待測樣本(ben)(ben)10μL，再加樣本(ben)(ben)稀(xi)釋(shi)液40μL；空白孔(kong)不加。

4.除空白(bai)孔(kong)外，標準(zhun)品孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)中每孔(kong)加入辣根(gen)過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封(feng)板(ban)膜封(feng)住(zhu)反應(ying)孔(kong)，37℃水浴鍋或恒溫(wen)箱溫(wen)育(yu)60min。

5.棄(qi)去液體，吸水(shui)紙上拍干(gan)，每孔加滿洗(xi)(xi)滌(di)液，靜(jing)置1min，甩(shuai)去洗(xi)(xi)滌(di)液，吸水(shui)紙上拍干(gan)，如(ru)此重(zhong)復洗(xi)(xi)板(ban)5次（也可用洗(xi)(xi)板(ban)機洗(xi)(xi)板(ban)）。

6.每孔加入底(di)物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔(kong)加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔(kong)的(de)OD值。

結果(guo)判斷：

繪(hui)制標(biao)準曲(qu)線(xian)：在(zai)Excel工作(zuo)表中(zhong)，以標(biao)準品濃度作(zuo)橫坐(zuo)標(biao)，對應OD值作(zuo)縱坐(zuo)標(biao)，繪(hui)制出(chu)標(biao)準品線(xian)性回歸曲(qu)線(xian)，按曲(qu)線(xian)方程計算各樣本(ben)濃度值。

試劑盒性能：

1.準(zhun)確性(xing)：標準(zhun)品線性(xing)回歸與(yu)預期濃度相關(guan)系數R值，大于等于0.9900。

2.靈敏(min)度：檢測濃(nong)度小于1.0 ppb。

3.特異性(xing)：不與其它可溶(rong)性(xing)結構(gou)類似物交叉反應。

4.重復性：板內(nei)、板間變異系(xi)數均小于(yu)15%。

5.貯(zhu)藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.有效期(qi)：6個月(yue)

免責聲明：

試劑盒僅供研(yan)究使用，不(bu)(bu)得用于臨床(chuang)實(shi)驗或(huo)人(ren)體實(shi)驗，否則所產生的一切后果，由實(shi)驗者承擔(dan)，本(ben)公司概(gai)不(bu)(bu)負責。

嚴格(ge)按照說(shuo)明書(shu)操(cao)作(zuo)，實驗者(zhe)違反(fan)說(shuo)明書(shu)操(cao)作(zuo)，后果(guo)由實驗者(zhe)承(cheng)擔。